生物物理學技術在當今科研生產領域有著非常廣泛的應用，涉及到的學科更是包括了化學、生物學、材料學、藥學等等多學科門類。應用生物物理學技術往往能從另一個角度突破原有專業知識局限挖到意想不到的寶貝。本君一直從事新藥發現相關研究，但是長期以來受困于活性化合物的靶標尋找與確認。藥靶確認是新藥發現過程中的一個重要環節。特別是對于多靶點作用的天然產物以及基于表型篩選得到的各種活性化合物，確認藥靶成為了活性化合物和臨床候選藥物之間一道難以逾越的鴻溝。以往，這部分工作更多依賴于各種生物化學方法。近幾年，大量生物物理學技術手段被廣泛應用于活性化合物的靶標確認環節，這在某種程度上加速了新藥開發的速度，也為更多活性天然產物的成藥開發掃清了關鍵技術屏障。隨著自己對各種生物物理學技術的了解和應用，深感其在藥靶確認環節中大有用武之地。今天，就為大家介紹藥靶確認環節中使用較為廣泛的幾種生物物理學技術，算是端午節的福利吧。
藥“靶”確認是新藥發現的重要環節。圖片來自網絡
1. X-Ray Crystallography
眾所周知，X-射線單晶衍射技術在表征化合物結構中具有舉足輕重的作用。對于生物分子的結構解析，X-射線晶體學（XRC）同樣占據重要地位。在藥物研發過程中，活性化合物與生物分子復合物的共結晶（簡稱共晶）結構解析無疑成為了活性化合物藥靶確認的強有力武器。
有機小分子與蛋白質的共晶實驗。圖片來源：J. Med. Chem.
優勢：能明確化合物關鍵片段與生物分子直接相互作用的具體結合位點信息，這是其他技術所不能提供的。精確到原子級別的相互作用信息可以稱得上是藥物化學家手中的利劍。
局限：被研究的生物分子要能夠很好地結晶，并且能獲得化合物與生物分子的共晶。無法對相互作用強度進行相對定量。整個研究過程需要大量的生物分子，且實驗周期較長。
2. NMR (Nuclear magnetic resonance)
用于研究小分子有機化合物和生物大分子相互作用的核磁共振（NMR）技術有許多，比如STD-NMR，Water-LOGSY，1H/13C-HSQC，1H/15N-HSQC等等。總的來說，可以分為兩大流派。一派是通過大分子NMR信號變化確認相互作用形式（1H/13C-HSQC，1H/15N-HSQC等），另一派則是通過檢測小分子NMR信號變化確認相互作用形式（如STD-NMR，Water-LOGSY等）。
2D 1H/15N HSQC NMR。圖片來源：Nat. Rev. Drug. Discov.
STD-NMR分析人血清白蛋白和硝西泮類似物。圖片來源：J. Chem. Educ.
優勢：基于大分子的NMR檢測能解析出生物大分子的結構，通過滴定實驗計算出小分子與生物大分子結合強度Kd值；基于小分子的NMR檢測能明確小分子哪個結構片段與生物大分子存在相互作用，對生物分子的大小無要求，更不需要對其進行同位素標記。
局限：基于大分子的NMR檢測大多需要對蛋白進行大量13C和（或）15N的同位素標記，通常適用于分子量小于40 kDa的小蛋白；基于小分子的NMR檢測有時則會受制于小分子的結構而無法應用。
3. SPR (surface plasmon resonance)
如果說上述兩項技術是在研究小分子結構信息的基礎上拓展而來，那么表面等離子共振（SPR）技術似乎就是為研究大分子而生，該技術在研究生物大分子之間相互作用領域中有著不俗表現。就目前發展而言，檢測小分子與生物大分子的SPR技術也可分為兩種流派：一派是基于微流體表面感受器的檢測技術（固定生物大分子）；另一派是基于微陣列感受器靠CCD相機成像的檢測技術（固定小分子化合物庫）。
基于微流體表面感受器的SPR實驗。圖片來源：Cell
基于微陣列感受器的SPR實驗。圖片來源：Nat. Rev. Drug. Discov.
優勢：基于微流體表面感受器的SPR技術可以直接進行和時間相關的各種檢測，比如測定Kd，kon，koff的具體數值；基于微陣列感受器的SPR技術則具有超高通量的優勢，無論哪種SPR技術，它們都可以進行化學計量學研究（也就是一個靶點結合幾個活性化合物），并且靈敏度都非常高足以滿足目前各種常規檢測。
局限：第一種SPR技術需要固定生物分子到芯片上，固定過程中會導致部分失活，對于一些穩定性較差的生物分子難以應用這種方法；第二種SPR技術需要固定化合物庫到感受器上因此需要對化合物進行特定的共價修飾。
4. ITC (Isothermal titration calorimetry)
等溫滴定量熱（ITC）技術能夠測量生物分子與配體之間相互作用時的熱量改變。因其能測得分子間相互作用的各種熱力學常數（ΔH，ΔS，ΔCP），Kd值以及化學計量學結果被許多科研人員奉為驗證分子間直接相互作用的“金標準”。
ITC實驗結果。圖片來源：J. Med. Chem.
優勢：生物大分子和化合物均不需要任何化學修飾，量熱過程完全在溶液中進行，實驗結果直接反映分子間相互作用熱力學情況，結果可靠性高。
局限：生物大分子消耗巨大！巨大！巨大！許多研究人員抱怨滴定小分子與蛋白作用時產熱太小…太小…太小……
上述四大技術可稱得上是藥靶確認過程中應用相對廣泛的生物物理學技術。除此之外，還有一些相對小眾的技術手段用于確認藥靶，比如TSA（Thermal shift analysis）、DSC（Differential scanning calorimetry），質譜技術中的NC?MS（Non-covalent MS）、AS?MS（Affinity-selection MS）、HDX?MS（hydrogen–deuterium exchange MS）等等。由于篇幅所限，就不在這一一列舉了。
在藥物研發過程中，這些生物物理學技術除了應用于靶標確認，在基于片段的藥物發現（fragment-based drug discovery，FBDD）領域更是有著不俗的表現，這方面的報道很多，我也就不在此贅述了。
希望大家通過我的介紹對這些技術有所了解，也許將來再解決某個問題時腦中能閃過一道光影，然后拿出手機找到這篇文章。至少，在讀文獻時看到上面的類似配圖不至于一臉茫然。
最后，歡迎用過上述某個技術的同學積極踴躍留言。畢竟本君水平有限，難免有錯漏之處，大家多多交流哦。
參考文獻：
1. Biophysics in drug discovery: impact, challenges and opportunities. Nat. Rev. Drug. Discov., 2016, 15, 679-698
2. The Practice of Medicinal Chemistry 3rd.
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